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制片技術

固定

固定是組織處理最重要的一步,也是在整個制片過程中最無法補救的一步。所謂“固定”,就是組織離體后,用各種辦法

使其細胞內的物質盡可能接近其生活狀態時的形態結構和位置的過程。固定的目的是為了防止組織、細胞自溶與腐敗,防止細胞內

日本高清无码AVwww酶對蛋白質的分解作用,使細胞內的各種成分如蛋白質、脂肪、碳水化合物或酶類轉變為不溶性物質,以保持原有的結構與生活時

日本高清无码AVwww相仿。另外,組織固定后,具有硬化作用,增加了組織的韌性,有利于取材和組織脫水。如果標本沒有及時固定或固定不恰當,組

織已經自溶或腐敗,將無法逆轉。

固定的注意事項:

日本高清无码AVwww(1)固定必須及時:組織離體后,必須立即固定(在1小時內)。

(2)固定液的選擇:固定液的選擇非常重要,應該根據制作要求選擇合適的固定液。最常用的固定液是4%甲醛液或4%中性緩沖甲

醛液。

日本高清无码AVwww(3)固定液的量:必須大于組織體積的4-10 倍。

(4)固定液的濃度:濃度必須準確,過稀或過濃都會影響組織的形態和固定的效果。

日本高清无码AVwww(5)固定液的質量:發現固定液變質,如甲醛液體產生白色沉淀,應立即更換。

日本高清无码AVwww(6)固定的溫度:室溫或放于35-37℃的全封閉組織處理機內,溫度過高,會加快組織的自溶和組織的過度收縮,并破壞細胞內的

抗原和DNA。

日本高清无码AVwww(7)固定的時間:新鮮標本,應該剖開固定12-24小時后再取材。大標本取材后在室溫下還需再固定4-6小時,小標本取材后應該

日本高清无码AVwww在室溫下再固定3-4小時,如果是新鮮小標本取材,必須再固定4-8小時。如果室內溫度低,固定時間還需延長。固定時間不超過48

小時。

(8)需要做分子病理的標本,從標本離體至組織脫水開始,總固定時間一般不要超過24小時(厚度2mm),同時決不要少于6小

時。

(一)最常用的固定液:

日本高清无码AVwww(1)4%甲醛液(10% 福爾馬林液):甲醛(HCHO)是一種無色易溶的刺激性氣體。市售甲醛水溶液實際濃度為40%,易揮發,日久

會自行分解,產生白色沉淀(副醛:多聚甲醛或三聚甲醛),并有甲酸產生,影響組織的固定和細胞核的染色。長期保存應該加入碳

日本高清无码AVwww酸鎂、碳酸鈣等碳酸鹽中和。我們用作病理標本固定的為4%甲醛水溶液(9份水加1份濃甲醛液,實際含甲醛4%,俗稱10% 福爾馬

日本高清无码AVwww林液)。甲醛是通過使蛋白質分子發生交聯而產生固定作用,組織穿透性好,組織收縮小,HE染色對比鮮明 ,能完好地保存組織

的形態。但交聯和共價鍵的形成改變了蛋白的三維結構并覆蓋了抗原的決定簇,降低了組織的抗原性,因此,現在國際上都提倡使

用10%中性緩沖福爾馬林液。

優點:①滲透能力較強,固定均勻。②收縮小。③能保存脂肪和類脂體(冰凍切片法)。④增加組織韌性。⑤有利于嗜銀染色。⑥

可固定高爾基體和線粒體。

缺點:①不能沉淀核蛋白的白蛋白。②溶解組織內尿酸鹽結晶。③經甲醛固定的陳舊組織較容易產生色素沉淀。(可用堿性乙醇去

日本高清无码AVwww除:濃氨水1ml加入75%乙醇200ml內,切片脫蠟后浸入上述液體30分鐘;或者1%氫氧化鉀1ml加入80%乙醇100ml內,切片脫蠟后浸入

日本高清无码AVwww上述液體10分鐘。如還沒有去除干凈,可以再延長,處理完成后流水沖洗5分鐘,常規染色)。

(2)4%中性緩沖甲醛液(10%中性緩沖福爾馬林液):能完好地保存組織的形態,并使蛋白質、核酸等大分子在細胞內原位凝固沉

日本高清无码AVwww淀,防止這些物質的崩解和彌漫流失,對大多數抗原和腫瘤基因等保存較好,是免疫組織化學和分子病理最常用的固定液,固定時

日本高清无码AVwww間24-36小時為宜。

4%中性緩沖甲醛固定液配方:甲醛100ml,蒸餾水900ml,磷酸二氫鈉(NaH2PO4?H2O)4g,磷酸氫二鈉(Na2HPO4)6.5g,用1N

日本高清无码AVwwwNaOH調整pH至7.0。(由于國內甲醛質量不穩定,取甲醛120ml,蒸餾水880ml,磷酸二氫鈉(NaH2PO4? H2O)4g,磷酸氫二鈉

(Na2HPO4)13g,效果更好)。

作者觀點:

(1)10%福爾馬林液是最常用的病理標本固定液,由于免疫組化和分子病理的開展,我們提倡使用10%中性緩沖福爾馬林液,以便

日本高清无码AVwww更好地保存抗原及腫瘤基因。我們對很多組織分別使用10%中性緩沖福爾馬林液和10%福爾馬林液固定后進行免疫組化結果對照,

雖然發現大多數抗原保存差異并不是很明顯,但是,對少數組織的抗原和FISH癌基因檢測(如Her-2)等影響較為明顯。因此應該

使用10%中性緩沖福爾馬林液,如果星期六、星期日休息的單位,應該在固定時間結束后,把組織長時間停留在75%乙醇、95%酒精

中。

(2)由于HE染色核的等電點pH為3.3-3.6,經10%中性緩沖福爾馬林液固定后,在一定程度上改變了細胞核的pH值,影響細胞核與

日本高清无码AVwww蘇木精染料的結合,導致細胞核容易發灰,特別是固定不充分的情況下。

(3)固定不佳的組織,由于脫水劑(乙醇)能使蛋白質發生凝固,使脫水劑難以滲入到組織中去,造成組織脫水不佳;同時乙醇

日本高清无码AVwww又起到凝固性固定的作用,使交聯與凝固性固定在不同程度上混合,對抗原的保存起到了不良的影響(如AAF固定液)。因此,固

定是組織處理過程中最重要的一步:固定充分的組織,由于固定液已經全部滲透到組織中去并與組織結合,細胞質、組織結構都已

日本高清无码AVwww經固定,脫水劑很容易將組織中的固定液和水分置換出來,因此固定好的組織很容易脫水;同時固定不足對抗原的影響遠遠超過了

日本高清无码AVwww固定過度所造成的影響。

(4)固定時間、固定液濃度與滲透速度:手術切除器官及腫瘤標本的固定和取材后標本的固定不盡相同,手術切除標本,由于具

有一定的立體外形、包膜等,固定液濃度過高,往往會過引起周圍組織收縮,影響固定液浸透到組織深處,造成組織中央固定不

佳;固定液濃度過低,容易造成組織邊緣水腫而組織中央固定不佳的現象。當手術標本過大時,如脾、腎、全胃、腸等臟器,由于

滲透速度的因素:10% 福爾馬林液固定液,24小時只能穿透2-3mm的實體組織和5mm的多孔疏松組織(滲透的速度受標本的致密度、

日本高清无码AVwww包膜的厚度、包膜外有無脂肪包裹、固定液的量、溫度等因素影響;而取材后的組織,上下二面組織被刀切過,固定液容易滲

日本高清无码AVwww透),如標本的厚度超過5mm,經24小時固定后,通常只有靠近邊緣1-2mm左右的組織固定好,而中央的組織固定不佳,甚至腐爛。

日本高清无码AVwww因此此類標本應該切開固定,剖開標本厚度以3-5mm為佳,當標本超過厚度后,甲醛與組織的結合速度會變慢。

日本高清无码AVwww第二天取材后的標本,脫水前還應該固定6-8小時。

日本高清无码AVwww在一定范圍內,固定液濃度高,所需固定時間短(但固定濃度過高,組織容易發硬,細胞收縮明顯);而固定液濃度低,所需固定

的時間長(過低的固定液濃度,會導致組織水腫,還容易引起組織變質)。因此合適的固定液濃度,不僅能快速的固定組織,還能

日本高清无码AVwww保存其優良的細胞形態、結構和抗原。

(5)固定速度與溫度的關系:固定液溫度(加溫或室溫)越高,固定速度越快,所需的時間就越短,同時細胞收縮也越明顯,

抗原丟失也越多,過高的溫度還會加速組織的腐爛(當標本體積大,組織中間固定液還未滲透到的部分由于溫度升高,細胞開始變

質);反之,溫度低,固定速度就慢,過慢的固定速度同樣也會使固定液未滲透到的組織發生變性。因此選擇合適的厚度和固定溫

度非常重要,大體標本應該剖開后在室溫下固定,取材后標本可選擇室溫18℃-25℃固定。當室溫開始下降后,應該逐漸延長固定

時間,最好能在37-45℃恒溫箱(或在全自動恒溫密封式脫水機)內固定。

(二)其它固定液:

(1)乙醇 CH3CH2OH:易燃、易揮發的無色透明液體,還原劑,可以被氧化成為乙醛,不能與鉻酸、重鉻酸鉀等氧化劑配成固定

日本高清无码AVwww液。優點:①乙醇有固定,硬化和脫水的作用。②保存糖原可用100%乙醇固定。③在保存漿、膜抗原上比10%中性福馬林更好。缺

點:①滲透力較弱,容易造成表面發硬,固定液較難滲透到組織深部。②能沉淀核蛋白,但沉淀物溶于水,導致核的著色不良。③

可溶解血紅蛋白和損害多種色素。④固定速度較慢。⑤對某些抗原有損傷。⑥對核抗原保存不利。⑦能引起組織、細胞的收縮。

95%乙醇常用于細胞涂片固定,組織標本固定一般不采用,只有在沒有福爾馬林的情況下,才能臨時使用,等送到有福爾馬林的科

室后應立即更換。目前很多環保固定液均為醇性固定液。

圖1-12 95%乙醇固定的組織,組織表面硬化

日本高清无码AVwww(2)乙酸 CH3COOH :又稱醋酸,由于該液體在氣溫16.6℃以下時,會結成冰狀固體,所以又稱冰醋酸。乙酸能沉淀核蛋白,使未

分裂細胞核的染色質沉淀成塊狀,可以清楚地顯示細胞核的結構。乙酸滲透性強,固定快,可以使組織膨脹,因此最好與其它液體

配合使用。如甲醛乙酸液:10ml甲醛,5ml乙酸,85ml水,對于HE切片固定效果好,細胞結構清晰,染色對比鮮明。但乙酸不能沉

淀白蛋白,也不能固定脂肪、糖和類脂。

日本高清无码AVwww(3)苦味酸( 2,4,6-三硝基苯酚):黃色晶體,密度1.767,凝固點122.5℃,爆炸點300℃,常制成飽和溶液貯藏。能沉淀蛋白

質,具有軟化組織的作用,同時還具脫鈣的作用。一般與其它液體配合使用,如Bouin液:飽和苦味酸水溶液75ml,甲醛20ml,乙

酸5ml。Bouin液是骨髓、睪丸等組織固定的良好固定液,適用于結締組織染色,尤其是三色染色時更為理想。由于固定液偏酸,pH

為1.7左右,對抗原有一定的損害,不適宜于標本的長期保存,固定時間12-24小時。經苦味酸或Bouin液固定后的組織必須流水沖

洗4小時以上。

(4)B-5固定液(乙酸鈉-升汞-甲醛固定液):滲透力較強,多用于固定淋巴組織。固定液配方:無水乙酸鈉1.25g,升汞6g,甲

日本高清无码AVwww醛10ml(用時加入),蒸餾水90ml。如果在此配方中不加甲醛,即為B-4固定液。凡使用B-5等用具有汞成分固定的組織,在染色

前,都必須先用0.5%碘酒(70%乙醇加入碘)脫汞處理。

日本高清无码AVwww(5)重鉻酸鉀 K2Cr2O7 :橙紅色板狀結晶,與可燃物接觸可能著火。比重2.676,熔點398℃,有毒性。常用1%-3%水溶液作固

定,穿透力極強,組織收縮小;可使蛋白質變為不溶性,不能使蛋白質沉淀(但在溶液中加入乙酸后,也能使蛋白質沉淀);對線

粒體、高爾基氏體的固定效果較好。重鉻酸鉀固定液的缺點是可使染色質溶解。經重鉻酸鉀固定的組織必須流水沖洗12小時以上。

(6)戊二醛 C5H8O2: 帶有刺激性氣味的無色透明油狀液體。戊二醛對糖蛋白、糖原、微管、內質網和細胞基質等都有較好的固

定作用,穿透力比四氧化鋨強,能保存某些酶的活力,長時間的固定也不會使組織變脆。但不能保存脂肪,對細胞膜的顯示也較

差,也無電子染色作用,所以戊二醛(2.5%水溶液)只能作電鏡組織處理的前固定,固定時間需2小時以上。

日本高清无码AVwww(7)鋨酸OsO4 :白色或淡黃色晶體,劇毒,強氧化劑,在使用時要注意對眼睛、呼吸器官、皮膚的保護。鋨酸對蛋白質、脂肪、

脂蛋白固定良好。有較強的電子染色作用,組織樣本圖象反差好,所以鋨酸(1%水溶液)常作電鏡組織處理的后固定。固定時間視

環境溫度而有所不同,室溫高于18℃-20℃時1小時,低于18℃-20℃時1.5?2.0小時(屬作者個人經驗)。缺點是固定時間過長容易

造成組織發脆,不容易切片。需在臨用前幾天配制以確保其充分溶解。

(8)Carnoy液:對于染色體固定較好,能很好地顯示DNA和RNA,固定速度快,一般3mm厚的組織塊固定1小時左右,較厚組織最好

也不要超過4小時。

固定液配方:乙酸10ml,氯仿30ml,無水乙醇60ml。

日本高清无码AVwww(9)Helly液:也稱Zenker福爾馬林液。對細胞質的固定較好,特別是細胞質內的特殊顆粒、胰島以及心肌閏盤保存都有良好的效

果。因其含有汞成分,故在染色前,應先用0.5%碘酒(70%乙醇加入碘)脫汞處理。

固定液配方:重鉻酸鉀2.5g,升汞5g,蒸餾水100ml,甲醛5ml。

日本高清无码AVwww(10)Kanovsky液:對細胞抗原、微細結構的保存較單純使用戊二醛效果要好,常用于免疫電鏡標本的前固定,一般采用先灌注、

再浸泡的固定方法。固定時間10-30分鐘,然后用緩沖液漂洗。最后用蔗糖液浸泡,恒溫冷凍切片。

日本高清无码AVwww固定液配方:25%戊二醛10ml,40%甲醛5ml,0.2mol/L二甲胂酸鈉緩沖液49ml,無水氯化鈣50mg,蒸餾水33.5ml(最后加入),

pH7.3。

日本高清无码AVwww(11)Rossman液:常用于糖原的固定。組織固定12-24小時后,用95%乙醇洗,無水乙醇脫水。

固定液配方:無水乙醇苦味酸飽和液90ml,甲醛10ml。

日本高清无码AVwww(12)Zenker液:對免疫球蛋白、病毒包涵體(如Negri小體)的固定效果較好,細胞核和細胞質染色比較清晰,常用于三色、磷

鎢酸-蘇木精等特殊染色的固定。對于含血量較多的標本不適合。固定時間12-36小時,加熱可加快固定作用。

日本高清无码AVwww固定液配方:儲存液由重鉻酸鉀2.5g,升汞5g,蒸餾水100ml 組成,用時再加入乙酸5ml。配法:將重鉻酸鉀和升汞加入蒸餾水,

日本高清无码AVwww加溫至40-50℃溶解,冷卻后過濾,保存于棕色玻璃磨砂瓶內。此液不能用金屬容器盛放,組織固定后,也不能用金屬鑷子夾取,

如果此配方中的乙酸用甲醛代替即為Helly液。

用Zenker液固定后的組織必須流水沖洗12小時去除重鉻酸鉀(也可用亞硫酸鈉溶液或1%的氨水溶液洗滌),在脫水前要先用0.5%碘

酒(70%乙醇加入碘)脫汞處理。

(13)4%多聚甲醛液:常用于免疫組織化學組織的固定。

日本高清无码AVwww固定液配方:4g多聚甲醛,溶于100ml蒸餾水,加溫至60℃,攪拌溶解。多聚甲醛不容易溶解,也可將液體放于密封瓶中,60℃溫

箱過夜溶解。

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時  間:2020-09-27 17:48

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